伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和E.coli体内生物膜形成的影响

【摘要】目的：在自然界细菌以单个游离悬浮状态和生物膜（biofilm，BF）状态两种形式存在。与浮游细菌相比，处于BF状态的细菌对不利条件，如干燥、极端温度、抗菌药物和消毒剂的抵抗力均明显增强。感染了BF的机体和污染了BF的生物材料，即使应用正常剂量数百倍的抗菌药物也难以奏效，因而常导致迁延难治性感染或严重公共卫生事件。伤寒沙门菌质粒pRST98是一种同时编码细菌耐药性和毒力的“嵌合性”质粒，在实验室和小鼠体内很容易通过接合作用从伤寒沙门菌（Salmonellatyphi,S.typhi,ST）传递至鼠伤寒沙门菌（Salmonellatyphimurium,S.typhimurium,STM）、大肠埃希菌（Escherichiacoli,E.coli）和痢疾杆菌等，且这些细菌彼此之间还可互相传递，导致宿主菌耐药性和毒力增强。由于伤寒沙门菌只感染人类，没有合适的动物模型，因此在本课题中，通过接合转移将pRST98分别转移至受体菌形成接合子STM/pRST98和E.coli/pRST98进行研究。本研究第一部分探讨伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响，比较受试菌STM，STM/pRST98，E.coli和E.coli/pRST98在浮游状态和BF状态下，细菌粘附侵袭、抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬能力的的差异。本研究第二部分以E.coli和E.coli/pRST98为研究对象，通过构建小鼠泌尿道插管模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98对E.coli在小鼠体内形成BF的影响。方法：一、伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响1.不同状态下细菌菌液的准备按常规方法将受试菌STM,STM/pRST98,E.coli和E.coli/pRST98增菌，制备单个游离悬浮状态的细菌菌液；将受试菌分别在常规条件下培养3d形成成熟BF，使用超声法将BF中的细菌均匀分散后，制备BF状态下的菌液。将游离细菌与BF细菌使用OD法和平板菌落计数法（colony-formingunit,CFU）确定浓度后，分别与小鼠结肠癌细胞CT26进行粘附侵袭、血清杀菌以及抗巨噬细胞吞噬实验，分别比较不同状态下受试菌毒力的差异以及pRST98对不同状态下宿主菌毒力的影响。2.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌粘附和侵袭CT26细胞的影响将实验菌株STM,STM/pRST98,E.coli和E.coli/pRST98按感染复数（multiplicityofinfection,MOI）100:1与CT26细胞共培养1h后，弃去菌液后用PBS洗涤细胞，破膜后用CFU比较受试菌对细胞的粘附力。侵袭实验与粘附实验基本相同，但在细菌细胞共培养1h后弃去菌液用PBS洗涤3次后每孔加入含阿米卡星（100μg/ml）的细胞培养液，作用3h后进行细胞内活菌计数。3.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗血清杀菌能力的影响用OD法和CFU法将不同状态的受试菌稀释至1×104CFU/ml，吸取20μl菌液分别加入含不同稀释度的兔和豚鼠血清0.2ml的试管，不含血清的普通肉汤管做CFU对照，根据预实验结果选择37℃，2h作为杀菌作用时间。用平板菌落计数法计算存活细菌数。4.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响STM作为兼性厌氧胞内菌，可在巨噬细胞内存活。用OD法和CFU法将浮游状态和BF状态下受试菌浓度调整至107CFU/ml待用。用血细胞计数板计数后将小鼠巨噬细胞J774A.1细胞浓度调整至5×105个/ml，分别加入6孔板，每孔1ml。将1ml不同状态的受试菌加入到各孔中，与细胞共作用1h。用含阿米卡星（100μg/ml）的RPMI1640培养液离心洗涤除去胞外菌，重新悬浮于含阿米卡星的培养液中，在不同时间点裂解细胞做CFU检测胞内活菌数。二、伤寒沙门菌质粒对E.coli体内生物膜形成的影响1.小鼠泌尿道插管模型的制备PE10塑料导管经消毒处理后分别于1×107CFU/ml的E.coli和E.coli/pRST98菌液中浸润24h，使受试菌粘附于导管表面。雌鼠进行麻醉、固定及消毒后，将准备好的PE10导管插入小鼠尿道并轻推至膀胱中。根据感染细菌的不同将小鼠分为两组，每组6只，实验重复3次。2.比较E.coli和E.coli/pRST98在体内形成BF的差异（1）激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）观察导管表面BF的形成感染后第5d小鼠经麻醉处死，将PE10导管从体内取出后用PBS洗涤，置于适量浓度为0.01%的吖啶橙染液中，于黑暗中静置染色10min再用PBS洗涤，将染色的导管置于载玻片上镜下观察。(2)扫描电镜（Scanningelectronmicroscopy,SEM）观察导管表面生物膜的形成将插管后第5天的小鼠麻醉后处死，取出膀胱中的PE10导管，用PBS轻柔洗涤，用2.5%的戊二醛溶液固定，用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗后，用1%锇酸后固定1h，再用连续梯度的叔丁醇溶液脱水，将导管取出进行临界点干燥和镀金后于SEM下观察导管表面BF的形态。(3)生物膜CFU计数按上述方法取得导管后，经PBS轻柔漂洗后置于1.0mlPBS超声振动20min，使生物膜中的细菌均匀分散至溶液中，进行CFU计数生物膜中的活菌数量。3.受试菌感染后小鼠脏器的变化插入导管后第8d经麻醉处死小鼠，肉眼观察小鼠的肝脏、肾脏和脾脏的病变。取其肝脏和肾脏固定于10%的甲醛中，经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等步骤，切片经HE染色后于显微镜下观察。结果：一、伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响1.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌粘附和侵袭的影响实验结果显示除E.coli外，各受试菌在BF状态下对细胞的粘附力明显增强，在BF状态和浮游状态下，pRST98对宿主细菌的粘附力无明显影响（p>0.05）。在两种不同状态下，与E.coli相比，STM对CT26细胞的粘附力更强。侵袭实验结果表明，形成BF后STM对CT26细胞的侵袭力明显下降(p<0.01)，E.coli组，也有相似趋势(p<0.05)。另外，pRST98在BF和浮游状态下对宿主菌侵袭CT26细胞的能力均无明显影响。STM对CT26细胞的侵袭能力强于E.coli(p<0.05)。2.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌抵抗血清杀菌能力的影响BF状态的受试菌STM,STM/pRST98,E.coli和E.colipRST98在兔血清和豚鼠血清中的存活率均高于浮游状态的受试菌(p<0.05)。在BF状态下，STM/pRST98和E.colipRST98抗兔血清和豚鼠血清杀菌能力亦分别明显高于STM和E.coli(p<0.05)。STM对血清杀菌的抵抗力显著高于E.coli(p<0.05)。3.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响BF状态下的STM在巨噬细胞内的存活率明显高于浮游状态下的细菌，说明在BF状态下细菌抗巨噬细胞吞噬能力增强，差异有统计学意义（p<0.05）。另外，可以发现BF和浮游状态下，STMpRST98在巨噬细胞内的存活率均高于STM（p<0.05）。二、伤寒沙门菌质粒对E.coli体内生物膜形成的影响1.比较E.coli和E.coli/pRST98在体内形成BF的差异成功建立小鼠插管模型。小鼠插管后活动正常，麻醉后处死小鼠从小鼠膀胱中取出导管。插管后第5d，E.coli和E.coli/pRST98可以在导管上形成BF，通过CLSM可以观察到E.coli/pRST98在导管表面形成的BF荧光信号明显强于E.coli。SEM下观察导管表面形成的生物膜发现，E.coli/pRST98感染组细菌聚集成团，形成成片的BF，而E.coli感染组细菌只是散落分布于导管表面不能形成明显的BF。CFU定量检测导管表面活菌数结果显示，E.coli/pRST98在导管上的定值数量明显高于E.coli（p<0.05）。2.受试菌感染后小鼠脏器的变化E.coli/pRST98感染组小鼠皮毛黯淡，精神萎靡，活动迟缓。感染后第8d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏明显充血肿大，表面有多发性小脓肿；病理切片HE染色后见小鼠肝脏细胞浊肿，肝小叶结构破坏且有炎性细胞浸润，肾脏有大量淋巴细胞浸润，肾小球结构破坏。E.coli感染组小鼠皮毛、精神及活动均正常，感染后第8d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏稍肿大，但无多发性小脓肿；病理切片HE染色可见小鼠肝细胞水样变性和炎症细胞浸润，肾脏细胞水样变性及淋巴细胞浸润。结论：1.BF的形成在促进细菌对小鼠结肠癌细胞CT26粘附的同时降低了细菌对细胞的侵袭。2.BF形成能显著增强细菌抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬的能力，使毒力增强。3.伤寒沙门菌质粒pRST98能增强浮游和BF状态下STM和E.coli对血清杀菌和巨噬细胞吞噬的抵抗力。4.伤寒沙门菌质粒pRST98能促进E.coli在小鼠体内形成BF。
【作者】刘珍；
【导师】黄瑞；
【作者基本信息】苏州大学，病原生物学，2014，硕士
【关键词】鼠伤寒沙门菌；大肠埃希菌；生物膜；伤寒沙门菌质粒；小鼠模型；

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